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不同純度花生紅衣原花青素的制備工藝研究

作者: admin 時間:2020-07-22 來源:未知
摘要:花生紅衣作為花生生產過程中價值極低的副產物,除了用于動物飼料外,大部分被當作廢棄物而造成資源浪費。近些年研究發現,花生紅衣中富含多酚類物質,具有很高的營養和利用價...

花生紅衣作為花生生產過程中價值極低的副產物,除了用于動物飼料外,大部分被當作廢棄物而造成資源浪費。近些年研究發現,花生紅衣中富含多酚類物質,具有很高的營養和利用價值?;ㄉt衣中多酚類物質含量為90~125mg/g,包括白藜蘆醇、原花青素、酚酸等物質,其中原花青素占花生紅衣總質量的17%,約有50%為生物活性較高的低聚體。原花青素具有較強的抗氧化能力,可作為防癌、防治心血管疾病藥物的主要有效成分,可用作安全無毒的新型天然抗氧化劑。目前,市場上原花青素產品大部分是葡萄籽來源的原花青素,葡萄籽中只含有B型原花青素,其聚合度較高,平均聚合度可達14.3。近年來研究較多的花生紅衣富含A型原花青素,聚合度較低,平均聚合度為3.2。研究發現只有低聚體原花青素(聚合度≤3)可以完全被胃腸道吸收,A型與B型原花青素在人體內發揮的作用不同。鑒于花生紅衣與葡萄籽來源的原花青素不同,有待于開發花生紅衣來源的原花青素產品。

不同純度的原花青素在食品、保健品、藥品以及化妝品等領域有一定的應用,市場對其純度的需求也不同。目前分離純化方法主要有溶劑萃取法、層析法、液相制備色譜等,但大孔樹脂法應用最為廣泛,其設備簡單、操作方便、便于工業化生產。本文采用大孔吸附樹脂對花生紅衣原花青素進行分離純化,并用HPLC-MS對純化產物進行分析鑒定。

花生紅衣原花青素的提取

用小型高速粉碎機將花生紅衣粉碎至過40目篩,每千克花生紅衣采用10L石油醚去除脂類物質,于30℃恒溫水浴鍋中脫脂5h,抽濾,濾渣置于通風櫥中去除石油醚,保存在干燥器中備用。每千克脫脂花生紅衣采用10L體積分數為70%的乙醇溶液提取,在超聲功率120W、超聲溫度35℃的條件下,超聲提取10min,相同條件下提取3次。合并過濾得到的濾液,旋轉蒸發至干,得到花生紅衣原花青素粗提物。

大孔吸附樹脂純化花生紅衣原花青素

大孔吸附樹脂的預處理

大孔吸附樹脂常含有一些單體、分散劑和致孔劑等,使用時需要除去這些有毒的有機殘留物,所以必須經過預處理。預處理方法:無水乙醇浸泡24h→用無水乙醇洗至流出液與水1∶5不渾濁→用去離子水洗至無醇味→5%HCl溶液浸泡2~4h→用去離子水洗至流出液為中性→2%NaOH溶液浸泡2~4h→去離子水洗至流出液為中性,備用。

大孔吸附樹脂的靜態吸附和解吸試驗

將經預處理后的大孔吸附樹脂抽濾并吸干其表面水分,準確稱取4種預處理后的樹脂1g分別置于25mL具塞錐形瓶中,各加入10mL(質量濃度為5.02mg/mL)花生紅衣原花青素粗提液,搖勻,放入氣浴恒溫振蕩器中,振蕩速率為120r/min,溫度為30℃。在0.5、1、2、3、4、5、6、12、18、24h時吸取上清液,測定上清液中原花青素的含量,并以吸附量對時間作圖,得到各樹脂的吸附動力學曲線。過濾吸附飽和的樹脂,分別加入20mL95%乙醇,在氣浴恒溫振蕩器中振蕩24h,過濾解吸液,測定其中原花青素含量。按下式計算吸附率、吸附量和解吸率。

(1)吸附率=(C0-C1)/C0×100%

(2)吸附量=(C0-C1)×V1/m

(3)解吸率=C2×V2/(C0-C1)×V1×100%

式中:C0為花生紅衣原花青素粗提液質量濃度,mg/mL;C1為經樹脂吸附后上清液中原花青素質量濃度,mg/mL;C2為原花青素解吸液質量濃度,mg/mL;V1為經樹脂吸附后上清液體積,mL;V2為原花青素解吸液體積,mL;m為干樹脂質量,g。

大孔樹脂AB-8純化花生紅衣原花青素

稱取已處理的AB-8大孔吸附樹脂裝填入層析柱,將一定質量濃度的花生紅衣原花青素粗提液(以澄清為好)上柱,柱溫為室溫;洗脫時首先用4BV蒸餾水洗去相對分子質量較大的蛋白質、多糖等雜質;然后用4BV不同體積分數的乙醇溶液將吸附在樹脂上的原花青素梯度洗脫下來,分批收集流出液,旋轉蒸發至干,得到原花青素純化物。接下式計算產物原花青素的純度和回收率。

(4)純度=純化物中原花青素質量/純化物質量×100%

(5)回收率=洗脫液體積×洗脫液中原花青素質量濃度/(上樣液體積×上樣液中原花青素質量濃度)×100%

原花青素的測定

原花青素標準曲線的繪制

準確稱取0.0500g原花青素標準品,加甲醇溶解并定容至25mL,得到2.0mg/mL的原花青素標準溶液(現配)。分別精確量取0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0mL原花青素標準溶液于10mL棕色容量瓶中,用甲醇稀釋至刻度線,此時得到質量濃度分別為0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.60、0.80mg/mL的工作溶液。再各取1mL工作溶液于10mL試管中,分別加入6mL0.04g/mL香草醛甲醇溶液,3mL濃鹽酸,搖勻,在(30±1)℃下恒溫水浴保持20min,取出,在500nm波長下測定其吸光度,繪制標準曲線?;貧w方程為Y=1.3306X+0.0664,R2=0.9966。

花生紅衣原花青素的測定

取1mL稀釋了一定倍數的花生紅衣原花青素粗提液,分別加入6mL0.04g/mL香草醛甲醇溶液,3mL濃鹽酸,搖勻,在(30±1)℃下恒溫水浴保持20min,取出,在500nm波長下測定其吸光度,由標準曲線回歸方程可計算樣品中原花青素的質量濃度。

1.2.4HPLC-MS測定花生紅衣原花青素

將洗脫級分10mg分別溶于10mL色譜純甲醇中,經0.45μm濾膜過濾后進行HPLC-MS分析。

色譜條件:色譜柱為CSH柱(2.1mm×100mm,粒徑1.9μm);流動相A為乙腈,流動相B為0.1%甲酸水溶液;柱溫45℃;進樣量1μL;流動相洗脫條件為0~0.1min,5%A;0.1~30min,5%~20%A;30~32min,20%~80%A;32~32.5min,80%~5%A;32.5~35min,5%A。

質譜條件:ESI電離源,負離子模式;毛細管電壓3.0kV,錐孔電壓40.0V;離子源溫度100℃,脫溶劑溫度400℃;錐孔氣流速50.0L/h,脫溶劑氣流速700.0L/h;碰撞電壓6V;相對分子質量掃描范圍(m/z)50~2000。

2結果與討論

2.14種大孔吸附樹脂對花生紅衣原花青素的靜態吸附率和解吸率

大孔吸附樹脂是吸附性和分子篩原理相結合的分離介質,其吸附力與吸附樹脂和吸附質之間的范德華力和氫鍵作用有關。本試驗所用大孔吸附樹脂包括極性樹脂(NKA-9)、中極性樹脂(HPD750)、弱極性樹脂(AB-8)和非極性樹脂(D101):

NKA-9和AB-8大孔吸附樹脂對原花青素均有較大的吸附率,D101大孔吸附樹脂的吸附率低于其他大孔吸附樹脂。原花青素分子中含有多個酚羥基,可形成氫鍵,具有一定的親水性和極性,容易被極性、中極性和弱極性樹脂吸附。除此之外,大孔吸附樹脂的吸附能力還與其孔隙結構、比表面積等有關。HPD750比表面積大,孔徑小,不利于原花青素分子通過樹脂的孔徑擴散到其內表面而被吸附。NKA-9表面極性大,對原花青素分子產生強烈吸附,會阻礙原花青素的解吸。大孔吸附樹脂的靜態動力學曲線一般可以分為兩種類型:第1種是快速平衡型,其特征是在吸附的起始階段吸附量迅速增加,很快達到吸附平衡;第2種是慢速平衡型,起始階段吸附量較小,吸附量的上升速度緩慢,吸附平衡時間較長。AB-8、NKA-9、D101樹脂對原花青素的吸附屬于快速平衡型,而HPD750則屬于慢速平衡型。因此,綜合考慮樹脂吸附量、解吸率以及靜態吸附動力學特征發現,AB-8大孔樹脂吸附量大、解吸容易并可以較快達到吸附平衡,故選用AB-8大孔吸附樹脂作為分離純化花生紅衣原花青素的吸附材料。

上樣流速對AB-8大孔吸附樹脂吸附原花青素的影響

上樣流速小,樣液中溶質與樹脂接觸時間長,其吸附較為完全;流速過大,溶質分子來不及擴散到樹脂的內表面進行吸附,導致吸附不充分,且浪費了樣品。因此,本試驗研究上樣流速對AB-8大孔吸附樹脂吸附原花青素的影響:

上樣流速為0.25mL/min和0.5mL/min時,大孔樹脂對原花青素的吸附率比較高,泄漏時間分別出現在250min和180min。當上樣流速為0.75mL/min和1.0mL/min時,泄漏時間出現較早,吸附過程不完全??紤]到實際的生產情況,選取0.5mL/min上樣流速較為合適。

洗脫流速對原花青素洗脫效果的影響

為了使洗脫液與AB-8大孔吸附樹脂所吸附的溶質有充分的接觸時間,進行有效地解吸,必須使洗脫液以合適的流速進行洗脫,因此考察了洗脫流速對原花青素洗脫效果的影響:

洗脫流速為0.5mL/min和1.0mL/min時,洗脫效果相差不大,而當洗脫流速達到2.0mL/min以上時,洗脫效果明顯變差,原花青素純度也呈下降趨勢。因此,選擇洗脫流速為1.0mL/min,此時原花青素的解吸率為89.31%,純度為98.7%。

不同體積分數乙醇對原花青素的洗脫效果

大孔吸附樹脂進行分離純化時常用的洗脫劑為乙醇溶液,不同體積分數乙醇溶液的極性不同,其對原花青素的洗脫能力也有所差異,因此本試驗研究了不同體積分數乙醇溶液對原花青素的洗脫效果的影響:

乙醇體積分數對花生紅衣原花青素的洗脫曲線有很大的影響,其中40%乙醇溶液的洗脫曲線峰值最高,在0.8~2.5BV范圍內收集到的原花青素質量濃度相對較高。20%乙醇溶液對原花青素的洗脫效果較好,洗脫曲線有明顯的峰值,稍有拖尾現象。10%和95%乙醇溶液對原花青素洗脫能力差,洗脫曲線無明顯峰值。因此,可以通過收集不同范圍內的洗脫液來制備不同純度的原花青素。

洗脫方式或收集方式對原花青素解吸效果的影響

原花青素是由不同聚合度的兒茶素或表兒茶素組成的混合物,含有大量的酚羥基,樹脂吸附過程中極有可能發生氫鍵吸附,則不同聚合度的原花青素被吸附和解吸的過程和速度必然存在差異。因此,梯度洗脫極有可能獲得聚合度不同或純度不同的原花青素。列出不同體積分數乙醇洗脫收集到4種原花青素的解吸效果:

采用20%乙醇溶液進行洗脫得到的原花青素的純度最高,采用40%乙醇溶液進行洗脫,原花青素的回收率最大。因此,選擇20%和40%乙醇作為制備原花青素的洗脫劑。

另將20%和40%乙醇的洗脫液分別收集:

20%乙醇洗脫解吸得到的干重從多到少,純度從低到高再到低,在約2~3.5BV收集到的洗脫液中原花青素純度最高,占總干重的23.4%;40%乙醇洗脫解吸得到的干重從多到少,純度從高到低,在約0~2BV收集到的洗脫液中原花青素純度最高,占總干重的84.2%。

在工業生產中可根據產品要求選擇不同的洗脫方式或收集方式。當用20%乙醇進行洗脫時,收集2~3.5BV洗脫液可得到純度大于98%的原花青素,收集0~4BV洗脫液時可得到純度大于95%的原花青素;當用40%乙醇洗脫時,收集0~2BV洗脫液可得到純度85%~90%的原花青素,收集0~4BV洗脫液可得到純度約為80%的原花青素。

6HPLC-MS對花生紅衣原花青素純化物的分析結果

經AB-8大孔吸附樹脂分離得到的純化物均為低聚體原花青素,20%乙醇純化物的主要成分為A型原花青素二聚體和A型原花青素三聚體,40%乙醇純化物的主要成分為A型原花青素二聚體和A型原花青素四聚體。研究發現只有低相對分子質量低聚體(聚合度≤3)可以完全被胃腸道吸收。因此,試驗所制備的花生紅衣原花青素因其相對分子質量小,易于被人體吸收,在人體內可充分發揮其生理功能。

3結論

研究了AB-8大孔吸附樹脂分離純化得到不同純度花生紅衣原花青素的制備工藝。最佳分離純化條件為:上樣流速0.5mL/min,洗脫流速1.0mL/min,洗脫液20%和40%乙醇溶液。解吸后得到20%乙醇純化物和40%乙醇純化物,20%乙醇純化物純度最高,可達98.7%,回收率較低,為29.41%,40%乙醇純化物純度為86.2%,回收率較高,為5031%。通過不同的收集方式可得到不同純度的原花青素,因此在工業生產中可根據產品要求選擇不同的洗脫方式或收集方式。

由HPLC-MS分析可知,經AB-8大孔樹脂分離得到的純化物均為低聚體原花青素,20%乙醇純化物的主要成分為A型原花青素二聚體和A型原花青素三聚體,40%乙醇純化物的主要成分為A型原花青素二聚體和A型原花青素四聚體。


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